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Genome editing products

基因組編輯產品

 

常見問題

能:能。對于這種基因組編輯操作,您需要帶有靶點同源重組臂以及所需點突變的供體 DNA。供體 DNA 可以是一個質?;蛞粭l單鏈的寡聚核苷酸。供體 DNA 需要與基因組編輯工具(TALEN 或 CRISPR)進行共轉染?;蚪M編輯工具在靶點生成的 DNA 雙鏈斷裂(DSB),細胞在存在供體 DNA 的情況下,會將供體 DNA 作為修復模板,利用同源重組(HR)機制修復 DSB。 

易錦提供供體質粒設計及構建服務。我們能構建帶有目的修飾及靶序列同源重組臂的供體質粒。質粒同時會敲入篩選標記(如嘌呤霉素抗性基因)或 copGFP 報告基因。這些篩選標記兩端可帶有 loxP 重組位點,可以在需要時通過 Cre-loxP 重組從基因組上去掉篩選標記序列。使用易錦提供的供體質粒,能減少篩選的克隆數,方便挑出所需的修飾陽性細胞系。

答:用同源重組(HR)方法做基因組編輯有幾大理由:1)HR誘導的基因組編輯具有精確性和可控性,可以實現幾乎任意基因序列操作;2)您可以通過同時敲入篩選標記(如抗性基因或熒光報告基因),大大提高篩選陽性克隆的簡便性。

易錦提供供體質粒設計及構建服務。我們能構建帶有目的修飾及靶序列同源重組臂的供體質粒。質粒同時會敲入篩選標記(如嘌呤霉素抗性基因)或 copGFP 報告基因。這些篩選標記兩端可帶有 loxP 重組位點,可以在需要時通過 Cre-loxP 重組從基因組上去掉篩選標記序列。使用易錦提供的供體質粒,能減少篩選的克隆數,方便挑出所需的修飾陽性細胞系。

答:我們的基因組編輯服務實際上可以適用于任何物種。我們的 TAL 效應子和 CRISPR 質粒的載體適用于哺乳動物細胞。此外,這些質粒也可以用于 T7 啟動子啟動的體外轉錄,轉錄出的 mRNA 可用于轉染小鼠、斑馬魚、果蠅以及其他更多的模式生物。易錦也提供基因組編輯克隆定制服務,為客戶定制適用于其他生物的 TAL 效應子或 CRISPR 體系克隆。

答:是的。DNA 雙鏈斷裂(DSB)發生時供體 DNA 必須同時存在于細胞內才會被用作同源重組(HR)模板。 否則,細胞會用非同源末端鏈接(NHEJ)修復 DSB。

答:我們的 TAL 效應子和 CRISPR 質粒通常是不會在轉染實驗后整合到宿主基因組里的。不過我們仍建議客戶在篩選到單克隆細胞系后再在其中篩選質粒已經丟失的細胞系。您可以測試細胞系是否對質粒所含的抗性敏感,或觀察細胞系是否還在表達質粒的熒光報告基因。此外,我們的慢病毒型克隆在包裝慢病毒顆粒后能整合到基因組,但整合位點是隨機的。

答:CMV 或 EF1a 啟動子使得表達質粒 DNA 成為可能。我們建議您用對您的細胞系來說效率最高的方法。以下是一些方法,可以用于將我們的基因組編輯工具導入到細胞里:

1. 標準轉染

2. 電擊轉染.

3. 慢病毒轉導

4. DNA 或 mRNA 顯微注射。這種質粒需要含有 T7 啟動子,以便進行體外轉錄生成 mRNA。

 

答:如果您要在不使用同源供體的情況下用 TALEN 或 CRISPR 生成突變,就需要進行更耗時間精力的下游實驗來鑒別修飾成功的克隆。在轉染后,您需要盡可能多分離單克隆細胞系。之后的篩選步驟取決于修飾的本身,具體介紹如下:

1. 如果您是在引入插入或缺失,并且插入缺失的大小足以通過標準的瓊脂糖凝膠電泳進行分辨,那最簡單的方法是用引物擴增靶點序列來進行篩選。

2. 對于較小的插入缺失,您可以通過 T7 核酸內切酶 I 檢測篩選克隆。這種檢測方法能通過剪切錯配的雙鏈 DNA 檢測序列突變。易錦提供 IndelCheck™ CRISPR/TALEN 插入缺失檢測檢測體系以及靶點 PCR 引物定制服務。另外您也可以用 real-time PCR 方法進行篩選。

3. 如果您需要引入一個點突變,您可以選擇 Surveyor 檢測(另一種錯配酶切檢測方法)或 real-time PCR 檢測序列修飾。

4. 加入您引入的修飾會生成或破壞一個限制性內切酶位點,則可以通過酶切 PCR 產物的方法分辨修飾成功與未被修飾的等位基因。

5. 最后,可以采用桑格測序法測 PCR 產物,或使用二代測序法對全基因組進行測序來檢測突變修飾。不管選擇采用哪種測序方法,您都需要確認是部分還是全部等為基因都被修飾。

為了節省花在檢測修飾陽性克隆上的時間和經歷,易錦推薦您使用我們的供體克隆設計構建服務。我們會構建含有客戶所需修飾、靶序列區同源重組臂以及篩選標記和報告基因等元件的供體質粒。篩選標記及報告基因兩端可帶有 LoxP 重組位點,可以通過 Cre 蛋白介導重組反應在需要的時候去除這些序列。使用易錦提供的供體質粒能方便篩選修飾陽性的克隆,減少需要進行檢測的克隆數目。

 

答:對 safe harbor 整合,我們推薦使用引物對重組位點進行 PCR 擴增,或使用 Southern blotting 排除隨機整合。所有的 GeneCopoeia Safe Harbor 基因敲入試劑盒都包含有這個驗證 PCR 的引物組合。對于其他利用 HR 機制的基因編輯實驗,可以使用 PCR 辨別編輯位點。PCR 方法可以顯示出野生型和被修飾位點的 PCR 產物長度差異。產物是與修飾后位點長度一致的單一條帶,說明所有的拷貝都被修飾。如果出現兩條產物條帶,一條匹配醫生型一條匹配修飾后位點,說明至少一個等位基因仍未被修飾。Southern blotting 同樣可以在這種實驗中用來排除隨機整合。

 

 

 

 

 

答:我們的 TAL 效應子或 CRISPR 載體是設計成不會宿主體內復制或整合到宿主基因組的類型。這些質粒被瞬時轉染后,通常會在幾輪細胞分裂后丟失,不會進一步影響宿主細胞。在轉染后,細胞被低密度涂布,促進單克隆群落的生成。這些群落應進行檢測,確保質粒已經丟失。檢測可以采取抗性篩選的方法,觀察細胞是否對質??剐曰驅目股孛舾?;或者觀察質粒的熒光報告基因是否不再表達。我們建議使用 mRNA 而不是 DNA 進行轉染,來確保轉染的瞬時性。

 

 

 

 

 

答:能。TALEN 和 CRISPR 都有同時編輯多個拷貝的能力。編輯的效率受到不同因素影響,如細胞類型、轉染效率和 CRISPR/TALEN 的活性。

 

 

 

 

 

答:TAL 效應子與 CRISPR 都能識別特定靶點序列來進行基因組編輯操作。它們之間最大的不同是實現識別與編輯的方式。CRISPR 通過一段 sgRNA 識別長約 20 個堿基的靶點序列。這段靶點序列末端必須緊接有 N-G-G (PAM)序列。sgRNA 引導 Cas9 核酸酶剪切靶點。當使用 CRISPR 體系時,我們需要進行設計的是 sgRNA 的序列。

TAL 效應子由長約 34 個氨基酸的蛋白模塊串聯組成。這些蛋白模塊的氨基酸序列高度保守,除了第12,13位氨基酸可變,通過這兩位氨基酸殘基對靶序列進行識別。一種蛋白模塊特異識別一種堿基。

 

TAL 效應子可以與功能域(如核酸酶或轉錄調控因子)融合進行靶向的基因組編輯。在使用 TAL 效應子技術時,我們需要以正確的順序組合蛋白模塊來匹配靶點序列。

答:視乎您的實驗目的和需要。TALEN 和 CRISPR 體系各有各的優缺點。CRISPR 體系編輯基因的效率一般要高于 TALEN,且 CRISPR 對甲基化不敏感,更適用于多靶點編輯,這些方面對比 TALEN 優勢確實相當明顯。但另一方面,CRISPR,包括 Cas9 切口酶在內,都更容易有脫靶效應。視乎實驗目的,這對于某些實驗應用來說是個影響較大的問題。 

 

 

TALE

答:有。

 

CRISPR

答:Yes. 可以。我們也提供 Cas9 D10A 切口酶的表達克隆,也成功測試過雙切口酶方法。要使用切口酶生成 DNA 雙鏈斷裂(DSB),需要使兩條間距恰當的 sgRNA 正確地分別靶向斷裂位點兩側的雙鏈。此外,sgRNA 針對的靶點序列3端需要緊接有“N-G-G” PAM 序列,因此,不是每個位點的序列都合適雙切口酶方法。

 

答:可以。要使用切口酶生成 DNA 雙鏈斷裂(DSB),需要使兩條間距恰當的 sgRNA 正確地分別靶向斷裂位點兩側的雙鏈。生成的 DSB 足夠誘導靶點與供體克隆之間發生同源重組(HR)。這個方法好處是降低潛在的脫靶效應(脫靶造成的單鏈切口基本能被修復,不會誘發非同源末端鏈接引起插入確實突變),但并非沒有限制。sgRNA 針對的靶點序列3端需要緊接有“N-G-G” PAM 序列,因此,不是每個位點的序列都合適雙切口酶方法。

 

答:我們只提供裝載好客戶定制的 sgRNA 的 CRISPR 質粒。如果您需要陰性對照,我們可以提供裝有亂序 sgRNA 的 CRISPR 克隆。

 

答:能。

 

答:能。Cas9 有一種雙位點突變體完全不帶有核酸酶活性。這種突變體可以與一個轉錄調控因子(如VP64)融合,靶向特定的基因。您可以使用這種失活的 Cas9 和設計好的 sgRNA 配合用于抑制或干擾基因的轉錄。

 

答:可以。我們有非慢病毒型和慢病毒型兩種載體。我們也提供慢病毒顆粒包裝服務,為您提供表達 Cas9 和 sgRNA 的慢病毒顆粒。

 

答:很遺憾,這個方法對同源重組(HR)行不通。慢病毒以 RNA 的形式進入細胞,但 HR 的供體克隆需要以 DNA 的形式與 Cas9 及 sgRNA 同時進入細胞。

 

Safe Harbor

答:可以。易錦提供 TALEN 型和 CRISPR 型的 Safe Harbor 試劑盒,可以靶向人類 AAVS1 位點或者小鼠 ROSA26 位點。這些試劑盒能完全兼容我們的 Safe Harbor ORF 敲入克隆。

 

sgRNA 文庫

答:我們提供慢病毒顆粒、轉染級質粒 DNA 以及菌種型的混合文庫。

 

答:有。目前我們提供的標準文庫都是混合文庫,但如果您希望獲得單獨克隆的陣列文庫,聯系我們獲取報價即可。

 

答:可以。不過我們強烈建議您先建立一個可以穩定表達 Cas9 的細胞系,這樣能最大限度確保文庫的每個 sgRNA 表現度的一致性??梢韵葘⒛?Cas9 慢病毒克隆轉導到您的細胞。一旦你建立起穩定表達 Cas9 的細胞系,再使用 sgRNA 文庫進行轉導。

 

答:可以。我們慢病毒質粒是兩用的,既可以用來包裝慢病毒顆粒,也可以通過標準轉染方法轉染細胞。

 

答:在使用混合文庫時,要完全確保每細胞只被 1 條 sgRNA 感染、或者單細胞被文庫所有的 sgRNA 感染都是不可能的。但我們目前提供的文庫規模都不大,因此如果被感染的細胞總數達到 100 × 文庫的 sgRNA 數,那您應當能獲得接近完全的表現率。